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两性霉素B对阴道耐药假丝酵母菌药物敏感研究

中国实用妇科与产科杂志 2019-11-19 15:49:03

本文刊登于《中国实用妇科与产科杂志》2016年7期667-670页

作者:霍丽丽,刘朝晖

作者单位:北京大学第一医院妇产科,北京 100034

通讯作者:刘朝晖,电子信箱:23662161@qq.com

外阴阴道假丝酵母菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是一种常见的外阴阴道感染,其主要致病菌为白假丝酵母菌(85%~95%),光滑假丝酵母菌占非白假丝酵母菌的绝大多数。在VVC的治疗中发现一些耐药真菌,由于对抗真菌药物不敏感而造成病程迁延和反复发作,是临床中非常棘手的问题。本研究采集了临床VVC患者的白假丝酵母菌耐克霉唑、氟康唑、咪康唑、伊曲康唑各30株、普通VVC分离株30株、5株临床光滑白假丝酵母菌和3株克柔假丝酵母菌,比较假丝酵母菌对两性霉素B 24h的MIC值差异,以研究两性霉素B对白假丝酵母菌耐药株的敏感性。


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材料与方法

1.1    材料

1.1.1    菌株    受试菌株共160株, 2株质控株,即白假丝酵母菌ATCC64548和ATCC 64550,余下158株为临床株。120株白色假丝酵母菌(candida albicans)中,对克霉唑、氟康唑、咪康唑、伊曲康唑耐药各30株(丹麦Rosco纸片法),普通 VVC临床分离全敏感菌株30株,5株光滑假丝酵母菌(candidaglabrata),3株克柔假丝酵母菌(candida krusei)均来源VVC患者的阴道分泌物,在光学显微镜下观察到假丝酵母菌孢子,并用科玛嘉显色培养基鉴定,翠绿色为白假丝酵母菌,紫红色为光滑假丝酵母菌,淡(粉)红色边缘模糊有微毛为克柔假丝酵母菌。菌株均由北京大学第一医院微生态实验室提供。

1.1.2    抗真菌药物    抗真菌药物两性霉素B 100314-201204,用100%二甲基亚砜(DMSO)配制为25600 μg/mL储存液,于-20℃保存备用。

1.1.3    培养液    1L溶液含RPMI 1640(Gibco) 10.4 g,吗啡啉丙磺酸(morpholinepropanesulfonicacid,MOPS)(Amersco) 34.5 g (0.165 mol/L),用1mol/L NaOH及HCl调pH至7.0 (25℃),滤过灭菌,4℃备用。

1.1.4    主要实验仪器    真菌培养箱(MJ-Ⅱ)(上海一恒科技有限公司);超净工作台(天津市中环实验电炉有限公司);CX21光学显微镜(OLYMPUS公司);台式恒温震荡仪(THZ-D)(太仓市实验设备厂);单通道加样器、八通道加样器(德国Eppendorf公司);0.22 μm滤膜(北京经科宏达生物有限公司);麦氏比浊管(70900型)(法国Biomerieux Sa公司),96孔U型底细胞培养板(美国Corning公司)。

1.2    方法    参照文献CLSI M27-A3方案,计算抗真菌药物两性霉素B对160株白假丝酵母菌的24h MIC值。

1.2.1    菌悬液的制备    将菌株接种至沙保弱培养基上,置37℃孵育24 h。挑取生长24 h直径1 mm左右的假丝酵母菌菌落3~5个,悬浮于2 mL 8.5 g/L无菌氯化钠(NS)溶液中,调整其浊度达到0.5麦氏标准,相当于每毫升含(1~5)×106个菌细胞。用孢子相液基1∶2稀释后,再1∶1000稀释,使其浓度为每毫升(0.5~2.5)×103菌落形成单位(colony-forming units,CFU)。

1.2.2    抗真菌药液的制备    实验时将储存液解冻后分别用培养基倍比稀释,两性霉素B的质量浓度为0.03~16μg/mL,同时保证CLSI M27-A3方案要求的DMSO的最高接种浓度不超过1%。

1.2.3    质量控制    以白假丝酵母菌ATCC 64548和ATCC 64550为质控株进行质量控制。

1.2.4    结果判定    药物MIC终点判定:以肉眼观察清晰不浑浊孔为MIC判断终点,肉眼判断结合凝胶成像仪拍照得到最终结果。

1.3    统计学处理    菌的药物浓度呈倍数关系,对数转换后用均数±标准差表达,如不满足参数检验条件,就不做数据转换,用中位数和四分位数间距描述非正态数据,进行Kruskal-Wallis检验。所有分析用SPSS19.0软件。


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结果          

两性霉素B在各个耐药组的MIC值与非耐药组的24 h 的MIC值比较  两性霉素B对耐伊曲康唑和耐氟康唑组的MIC值与非耐药组无差异,说明真菌虽然已经对伊曲康唑或氟康唑耐药,但对两性霉素B仍然敏感。因光滑假丝酵母菌和克柔假丝酵母菌组的例数较少,无法统计,只是观察到两组的两性霉素B MIC值比普通VVC组的中位数值高。两性霉素B对不同的耐药组24 h MIC值比较  应用秩和检验比较各耐药组间24 h MIC值,差异有统计学意义(χ2=28.615,P=0.000)。两性霉素B对耐伊曲康唑组的MIC与耐氟康唑组差异无统计学意义,低于耐咪康唑组、耐克霉唑组。                  

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讨论

VVC是临床上常见的妇产科感染性疾病,占微生物所致阴道炎的28%左右,严重影响妇女的正常生活。刘朝晖等发现,在VVC中,白假丝酵母菌是主要致病菌。临床上治疗VVC的一线唑类抗真菌药物,因反复应用和不合理的应用已经使真菌对其产生耐药,且上升趋势明显。对唑类耐药的白假丝酵母菌的出现给临床有效治疗VVC带来了巨大挑战,故本研究选取的是对4种唑类药物耐药的白假丝酵母菌各30株,以观察两性霉素B对其的抗菌效果。两性霉素B作为一种多烯类抗真菌药物,主要通过以下几种机制发挥抗真菌作用:(1)8分子两性霉素B与真菌细胞膜的麦角甾醇结合,形成贯穿细胞膜的管状小孔,K+ 、核苷酸、膜蛋白和氨基酸等细胞内物质外泄,而一些细胞毒性物质内渗,从而使真菌生命力下降甚至死亡。(2)两性霉素B能够诱导细胞氧化损伤,耐受两性霉素B的真菌细胞,其细胞中过氧化酶酶活性升高,从而保护细胞不受氧化胁迫压力损伤。(3)两性霉素B除了杀伤真菌细胞外,它能刺激细胞产生趋化因子、前列腺素等免疫因子,对宿主免疫系统有调节作用。该药在临床上不常应用于治疗VVC,且两性霉素B与唑类药物的抗真菌机制不同使得其对VVC临床分离株有较高敏感性,对耐药的白假丝酵母菌依然有效。

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